標簽：Western ELISA 山羊抗兔Ig 二抗 抗體  IHC 辣根過氧化物酶標記


　　辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)

　　來源：Goat

　　用途：WB, ELISA, IHC

　　WB：1:1000

　　ELISA：1:250

　　IHC：1:50

　　WB, Western blot; ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent Assay; IHC, Immunohistochemistry.

　　本辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L))為進口分裝，用于Western、ELISA和IHC等的二抗。HRP，即horseradish peroxidase，中文名為辣根過氧化物酶，可以在Western檢測時催化ECL類試劑(如ECL、BeyoECL等)產生化學發光，可以在ELISA時催化TMB產生藍色，也可以在IHC或Western blot檢測時催化DAB產生棕色沉淀。

　　本辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)用于WB、ELISA和IHC的推薦稀釋比例參考上表，實際實驗操作過程中需根據抗原和抗體的具體情況適當調節二抗的稀釋比例。對于WB，推薦的稀釋范圍為1:500-2000。

　　本抗體為用純化的兔IgG免疫山羊，然后用親和純化柱對獲得的抗血清進行純化而獲得的二抗。

　　本抗體如果用于常規的Western檢測，以每次檢測需10毫升1:1000稀釋的二抗計，至少可以檢測100次。

　　山羊抗兔IgG(H+L),辣根過氧化物酶標記操作步驟：

　　(一)獲得目的基因

　　1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環獲得所需基因片段。

　　2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。

　　(二)構建重組表達載體

　　1、山羊抗兔IgG(H+L),辣根過氧化物酶標記(Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjug)載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

　　2、PCR產物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

　　(三) 獲得含重組表達質粒的表達菌種

　　1、 將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。

　　2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

　　3、 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。

　　(四)誘導表達

　　1、 山羊抗兔IgG(H+L),辣根過氧化物酶標記(Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjug)挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養。

　　2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

　　3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。

　　4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

　　5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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